脊髓灰质炎病毒（简称脊灰病毒，PV）属于小RNA病毒科肠病毒属，包含三种血清型（即PV1、PV2和PV3）。感染PV的患者常出现以肢体松弛性麻痹为主要症状的脊髓灰质炎，严重者可以导致瘫痪甚至死亡，多见于儿童，故又名小儿麻痹症。世界卫生组织（WHO）于1988年发起了“全球小儿麻痹症根除计划”，但至今尚未达到预期目标。多年来，口服减毒脊灰病毒活疫苗（OPV）和灭活脊灰病毒疫苗（IPV）的使用极大地降低了小儿麻痹症发病率和脊灰病毒感染率，但作为传统疫苗仍存在一定的局限性。OPV和IPV在生产上均依赖于大规模培养和操作具有感染性的活病毒，因此存在病毒意外泄露的风险；而OPV在接种者体内有可能回复突变为强毒株并释放到环境中，对公共健康构成潜在威胁。因此，为了实现全球范围内消除脊灰病毒的目标，急需开发一种在生产和接种过程中均不涉及使用活病毒的新一代脊灰疫苗。
2024年9月20日，上海市重大传染病和生物安全研究院黄忠研究员团队、中国科学院分子细胞科学卓越创新中心上海生物化学与细胞生物学研究所丛尧研究员团队和华淞(上海)生物医药科技有限公司刘庆伟团队共同在国际学术期刊Vaccines上发表题为“Vaccine Potency and Structure of Yeast-Produced Polio Type 2 Stabilized Virus-like Particles” 的研究论文，该论文报道了利用酵母重组表达系统高效制备PV2的病毒样颗粒（Virus-Like Particle，VLP）作为候选疫苗，并系统地研究其抗原性、热稳定性、免疫原性及结构特征。
研究人员根据野生型PV2毒株和热稳定突变株序列分别构建了共表达衣壳蛋白VP0、VP3和VP1的表达载体（HC-wtVP031和HC-sVP031），转化毕赤酵母后筛选获得高表达菌株，利用蔗糖梯度密度离心和电镜等方法确定了两个载体的相应转化酵母中的重组表达蛋白均组装为VLP，分别命名为野生型VLP（wtVLP）和热稳定VLP（sVLP）。抗原性分析结果显示，每微克的sVLP含有7.33 单位的保护性D-抗原，是wtVLP中D-抗原含量的2.6倍。研究人员进一步比较了wtVLP和sVLP的热稳定性。首先将两种VLP在30℃至60℃之间不同温度下分别孵育10分钟后再测定D-抗原，发现wtVLP在35℃处理后就丧失大于50%的D-抗原，而sVLP在45℃处理后仍保持大于50%的D-抗原。此外，将两种VLP在人体生理温度（37℃）条件下孵育不同时间后进行D-抗原测定，发现wtVLP在孵育10分钟后就失去50%以上的D-抗原，而sVLP在24小时后仍然保持其初始D-抗原水平。这些结果表明，sVLP颗粒的热稳定性明显优于wtVLP。
图1 在毕赤酵母中重组表达PV2型的wtVLP和sVLP
研究人员在小鼠模型上评价了wtVLP 和 sVLP的免疫原性。结果显示，用1μg/剂的wtVLP免疫小鼠未产生针对PV2的中和抗体；相反，同样剂量的sVLP疫苗能够有效地激发中和抗体，而且该中和抗体的滴度与0.5人剂量的商业化IPV疫苗所诱导的中和抗体滴度是相当的。此外，还发现添加氢氧化铝佐剂的低剂量（0.5μg/剂）sVLP疫苗所诱导的中和抗体滴度要显著高于无佐剂的高剂量（1μg/剂 ）sVLP组，表明氢氧化铝佐剂能够有效增强sVLP疫苗的免疫原性，从而达到降低抗原用量、提高疫苗供应能力的效果。
图2 PV2型wtVLP和sVLP在小鼠体内的免疫原性评价
研究人员进一步应用冷冻电镜技术解析了wtVLP和sVLP两种颗粒的高分辨率结构。从整体上看，两种VLP均为具有对称性的球形颗粒，其表面结构特征与其它肠道病毒类似。但是，这两种颗粒还有诸多不同：wtVLP的半径比sVLP的更大，呈现膨胀状态；wtVLP的二重轴上有一个开放通道，而在sVLP中是闭合的；sVLP的VP1疏水口袋中有神经鞘氨醇状的“口袋分子”，而wtVLP的疏水口袋是空的。进一步结构比对显示，PV2 wtVLP结构高度相似于PV1的膨胀态135S颗粒的结构，而PV2 sVLP结构与PV2的紧密状态成熟病毒颗粒的结构高度一致。研究人员还发现，与wtVLP相比，sVLP结构上有序部分更多且其B-factor更低，表明sVLP的结构更加稳定。从分子水平上看，sVLP包含的5个氨基酸位点突变（即VP1 TI， VP1 F134L，VP1 Y159F，VP3 L85F和VP3 Q178L）不仅使原体单元内相互作用更紧密，而且增大了五体内不同亚基蛋白间的作用界面，从而导致sVLP的构象更加紧凑和稳定。
图3 PV2型wtVLP 和 sVLP的冷冻电镜结构
综上所述，该项研究确定了酵母表达的PV2 sVLP作为新型脊灰疫苗的可行性和有效性，首次解析了PV2 sVLP的高分辨率冷冻电镜结构，并揭示了其组装和热稳定特性的分子机制。这些信息将有助于加快新一代脊灰疫苗的开发，为“全球小儿麻痹症根除计划”提供更加安全、高效的解决方案。
上海市重大传染病和生物安全研究院黄忠研究员、中国科学院分子细胞卓越创新中心丛尧研究员和华淞(上海)生物医药科技有限公司刘庆伟博士为该论文的共同通讯作者。中国科学院分子细胞卓越创新中心博士研究生洪琴和上海市重大传染病和生物安全研究院专任工程师王淑侠为该论文的共同第一作者。该研究得到了国家自然科学基金、上海市市级科技重大专项“重大突发传染病防控关键核心技术研究”、中国科学院先导专项的经费支持；同时得到国家蛋白质科学研究（上海）设施的冷冻电镜系统、数据库与计算分析系统的大力支持。
原文链接：https://www.mdpi.com/2076-393X/12/9/1077
