肠道病毒D68（EV-D68）是一种重新兴起的人类病原体，与呼吸道疾病密切相关，还可能导致急性弛缓性脊髓炎。近年来，美国等世界许多国家报告了多起与EV-D68感染相关的疫情。因此，EV-D68对全球公共卫生构成了严重威胁。然而至今尚无针对EV-D68的商业化疫苗或药物。目前已报道基于灭活病毒或病毒样颗粒（VLP）的EV-D68实验性疫苗，但对于这些疫苗抗原上负责诱导中和性抗体反应的抗原位点仍缺乏系统深入的研究。“中和抗原位点”是指一簇中和性抗体表位，其中每个表位至少彼此重叠。
近期，上海市重大传染病和生物安全研究院张超课题组在国际著名学术期刊 Journal of Virology在线发表了题为“Identification of four neutralizing antigenic sites on the enterovirus D68 capsid”的论文。该研究首次全面鉴定并比较了EV-D68原型株和临床株病毒衣壳上的中和性抗原位点。
在之前的工作中，研究者用重组EV-D68 VLP（基于临床株MO50）免疫小鼠，制备了两种中和性单抗2H12和8F12，它们均结合在病毒的受体结合区canyon附近，可阻断唾液酸受体结合，阻止病毒吸附细胞（Nature Communications, 2021）。在本研究中，为了制备更多的EV-D68抗体，研究者使用原型株Fermon和临床株MO47的灭活病毒进行小鼠免疫，制备了7种新的单抗，单抗1至7 (图1A)。之前开发的单抗2H12和8F12，重命名为单抗8和9。中和实验显示单抗1至5和9可以有效中和原型株Fermon，而单抗 6至9可以有效中和临床株MO47。此外，发现单抗1至5可以以抗体剂量依赖性方式抑制原型株Fermon病毒对细胞的结合(图1B)，单抗6和7可以完全阻断或显著抑制临床株MO47病毒对细胞的吸附(图1C)。综上，这9种EV-D68抗体都可以抑制病毒吸附，尽管效率不同。
图1. EV-D68中和性抗体的制备、表征和中和机制。
通过选择和分析中和逃逸突变株来鉴定单抗的表位。单抗1至5和9用于从原型株Fermon毒种中选择中和抗性突变株，测序分析突变位点，然后定量测定每个突变株对每种单抗中和的抗性。Fermon的突变株和抗体可分为三个不重叠的组，命名为A、B和C (图2A)。组A包含使用单抗1和2选择的突变株1.1、2.1和2.2。组B包含用单抗3至5选择的突变株3.1、4.1和5.1。组C只含有用单抗9选择的分离株9.1和9.2。这些结果表明原型株Fermon病毒存在三种不同的中和性抗原位点。突变残基被定位到Fermon病毒颗粒的3D结构上(图2B-D)。发现这些残基都暴露在病毒表面。抗原位点A包括残基G1085和H1087，位于VP1 BC loop并靠近病毒的5重轴（图2B）。对于抗原位点B，残基K2070位于VP2 βB中，而残基Q3079位于VP3 BC loop中，抗原位点B很可能跨越病毒不同结构单元之间的边界（图2C）。抗原位点C包括残基T2137和G2142，在VP2 EF loop中，位于受体结合区canyon边缘（图2D）。
单抗6至9用于从临床株MO47毒种中选择逃逸突变株，测序分析突变位点，然后定量分析每个突变株对每种单抗的中和抗性。MO47的突变株和抗体可分为三个独立的组，称为D、E和F（图2E）。组D仅包含用单抗6选择的突变体6.1和6.2。组E仅包括单抗7选择的突变体7.1。组F包含用单抗8和9选择的突变体8.1、9.3和9.4。这些结果表明临床株MO47病毒中存在三种不同的中和性抗原位点。抗原位点D至F被定位到MO47病毒结构上。抗原位点D包含残基S1081和R1085，位于VP1 BC loop并靠近病毒的5重轴（图2F）。抗原位点E由残基D1285和N1293组成，位于VP1的C末端（图2G）。抗原位点F包含残基T2139和G2142，位于VP2 EF loop和受体结合区canyon的南侧（图2H）。
图2. EV-D68原型株Fermon（A-D）和临床株MO47（E-H）中和性抗原位点的鉴定。
将原型株Fermon和临床株MO47的抗原位点综合分析并总结在图3A-B中。Fermon株的位点A和MO47株的位点D均位于VP1 BC loop，围绕病毒的5重轴，处于受体结合区canyon的北缘。因此，位点A和D实际上是EV-D68的同一位点，重命名为位点I，包括残基1081、1085和1087。Fermon株的位点C和MO47株的位点F均位于VP2 EF loop和受体结合区canyon的南侧。因此，位点C和F实际上是EV-D68的同一位点，更名为位点II，涉及残基2137、2139和2142。MO47株的位点E被重命名为位点III，由VP1 C端残基D1285和N1293组成，每个VP1的C端位于邻近结构单元的受体结合区canyon的南侧。Fermon株的位点B重命名为位点IV，包含来自一个单元的残基2070（βB链）和相邻单元的残基3079（BC loop）。先前报道的保护性抗体15C5也靶向位点IV，选择出L3074S逃逸突变。因此，位点IV包括残基2070、3074和3079，靠近3重轴，可能跨越病毒五聚体之间的边界。
图3. EV-D68中和性抗原位点总结和抗原结构。
综上，该研究揭示了EV-D68病毒衣壳上存在4个离散的、功能上相对独立的中和性抗原位点，促进了EV-D68被中和抗体识别以及病毒进化和免疫逃逸分子机制的理解, 还为理性开发针对EV-D68感染的新型疫苗和抗体药物提供了重要信息。
南京医科大学国家疫苗创新平台特聘教授代文龙和中国科学院大学硕士研究生李雪为本文第一作者。上海市重大传染病和生物安全研究院PI张超青年研究员为本文通讯作者。该研究得到了上海市科技重大专项和上海市启明星项目的资金支持。
全文链接： https://doi.org/10.1128/jvi.01600-23
